Si svolge a Roma nel 1800. Angelotti console dell'ex Repubblica Romana è fuggito da Castel Sant'Angelo e si rifugia nella chiesa di Sant'Andrea della Valle, dove sua sorella la Marchesa Attavanti ha nascosto degli abiti femminili che gli permetteranno di passare inosservato. La donna è stata ritratta senza saperlo dal pittore Marcio Cavaradossi. Questi si accorge di Angelotti che conosce da tempo il quale gli rivela la propria situazione. Improvvisamente vengono interrotti dall'arrivo di Tosca, che, riconoscendo nel dipinto della Maddalena le fattezze della marchesa, fa una scenata di gelosia a Mario, che a fatica riesce a calmarla e congedarla. Angelotti esce dal suo nascondiglio e riprende il discorso con Mario che lo indirizza nella sua villa. Improvvisamente sopraggiunge Scarpia capo della polizia che sospetta fortemente di Mario. Per trovare Angelotti cerca di coinvolgere Tosca suscitando la sua morbosa gelosia. La donna credendo alle parole di Scarpia giura di trovarli. Scarpia la fa seguire. Mentre a Palazzo Farnese Scarpia sta cenando Spoletta, uno scagnozzo, gli conduce Mario che è stato arrestato. Questi si rifiuta di rivelare dov'è Angelotti e viene condotto in una stanza e torturato. Giunge Tosca che stremata dalle grida di Mario confessa il nascondiglio dell'evaso. Mario indignato che Tosca abbia parlato, cerca di scacciarla. Scarpia lo condanna a morte. Disperata Tosca vuole donarsi a Scarpia se egli acconsentirà di liberare Mario. Scarpia convoca Spoletta e con un cenno di intesa fa credere a Tosca che la fucilazione sarà simulata e i fucili caricati a salve. Mentre sta scrivendo il salvacondotto che li porterà fuori dallo Stato Pontificio, Tosca aggredisce Scarpia e lo pugnala.
All'alba sui bastioni di Castel Sant'Angelo, Mario è pronto a morire. Scrive un'ultima lettera d'amore a Tosca che nel frattempo arriva e spiega di aver ucciso Scarpia. Lo informa della fucilazione simulata e scherzando gli raccomanda di fingere bene la morte. Ma Mario viene fucilato per davvero e Tosca inseguita dai poliziotti, che hanno scoperto la morte di Scarpia,si getta dagli spalti del castello.
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